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基因克隆的基本步骤有哪些118kj开奖现场开奖记录

发布日期:2019-11-09

  DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子,这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。

  由于基因组DNA较大,不利于克隆,因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段,常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。

  若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知,根据已知序列设计引物,从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。

  (1)在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力,这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。

  (2)分子量尽可能小,以利于在宿主细胞中有较多的拷贝,118kj开奖现场开奖记录。便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。

  (3)载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记(如抗药性标记基因),以赋予宿主细胞的不同表型特征(如对抗生素的抗性)。

  (4)载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点,为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应,则更有利于重组子的筛选。

  DNA克隆常用的载体有:质粒载),噬菌体载体,柯斯质粒载体,单链DNA噬菌体载体,噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲,根据载体的使用目的,载体可以分为克隆载体,表达载体,测序载体,穿梭载体等。

  体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端,用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端,黏性末端彼此退火,通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体,此为黏末端连接。

  当目的DNA片断为平端,可以直接与带有平端载体相连,此为平末端连接,但连接效率比黏端相连差些。

  有时为了不同的克隆目的,如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时,则要将平端DNA分子通过一些修饰,如同聚物加尾,加衔接物或人工接头,PCR法引入酶切位点等,可以获得相应的黏末端,然后进行连接,此为修饰黏末端连接。

  载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点,因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制,重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增,最终获得大量同一的重组DNA分子。

  将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化,转染,转导。重组质粒通过转化技术可以导入到宿主细胞中,同样重组噬菌体DNA可以通过转染技术导入。

  转染效率不高,因此将重组噬菌体 DNA或柯斯质粒体外包装成有浸染性的噬菌体颗粒,借助这些噬菌体颗粒将重组DNA分子导入到宿主细胞转导技术,这种转导技术的导入效率要比转染的导入效率高。

  从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下:

  外源DNA片段插入到位于筛选标记基因(抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因)的多克隆位点后,会造成标记基因失活,表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变,通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。

  提取转化子中的重组DNA分子作模板,根据目的基因已知的两端序列设计特异引物,通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆,用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。

  制备目的基因特异的核酸探针,通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。

  获得目的基因表达的蛋白抗体,就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体,也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。

  基因克隆技术的想法第一次出现在1972年11月在檀香山的一个有关质粒的科学会议上。(质粒是在细菌中发现的DNA环。质粒携带某些对抗生素的耐药性的基因。)一直在研究质粒的史坦利·科恩,对赫伯特·博耶网站上的关于细菌酶切割DNA分子中的特定部分的介绍很感兴趣。

  在一个深夜游览威基基的一间熟食店两位科学家相遇并谈到将合作领域的科学知识相结合,构思出了一个开创现代生物技术产业的实验。到1973年初,他们推出了一系列的实验,得到方法来选择特定的外源基因在细菌中复制。

  DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子,这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。

  由于基因组DNA较大,不利于克隆,因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段,常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果基因的两端部分序列已知,根据已知序列设计引物,从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。

  基因克隆常用的载体有:质粒载体、噬菌体载体、柯斯质粒载体、单链DNA噬菌体载体、噬粒载体及酵母人工染色体等。从总体上讲,根据载体的使用目的,载体可以分为克隆载体、表达载体、测序载体、穿梭载体等。

  体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有黏性末端,用同一种酶或同尾酶切割适当载体的多克隆位点便可获得相同的黏性末端,黏性末端彼此退火,通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体,此为黏末端连接。

  当目的DNA片断为平端,可以直接与带有平端载体相连,此为平末端连接,但连接效率比黏端相连差些。有时为了不同的克隆目的,如将平端DNA分子插入到带有黏末端的表达载体实现表达时,则要将平端DNA分子通过一些修饰;

  如同聚物加尾,加衔接物或人工接头,PCR法引入酶切位点等,可以获得相应的黏末端,然后进行连接,此为修饰黏末端连接。

  载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点,因此可以在原核细胞如大肠杆菌中复制,重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增,最终获得大量同一的重组DNA分子。

  从不同的重组DNA分子获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下:

  (1)插入失活法:外源DNA片段插入到位于筛选标记基因(抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因)的多克隆位点后,会造成标记基因失活,表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变,通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。常用的是β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法(白色菌落是重组质粒)。

  (2)PCR筛选和限制酶酶切法:提取转化子中的重组DNA分子作模板,根据目的基因已知的两端序列设计特异引物,通过PCR技术筛选阳性克隆。PCR法筛选出的阳性克隆,用限制性内切酶酶切法进一步鉴定插入片段的大小。

  (3)核酸分子杂交法:制备目的基因特异的核酸探针,通过核酸分子杂交法从众多的转化子中筛选目的克隆。目的基因特异的核酸探针可以是已获得的部分目的基因片段,或目的基因表达蛋白的部分序列反推得到的一群寡聚核苷酸,或其它物种的同源基因。

  (4)免疫学筛选法:获得目的基因表达的蛋白抗体,就可以采用免疫学筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体,也可从目的基因部分ORF片段克隆在表达载体中获得表达蛋白的抗体。

  1、平端连接:DNA连接酶可催化相同和不同限制性核酸内切酶切割的平端之间的连接。原则上讲,限制酶切割DNA后产生的平端也属配伍末端,可彼此相互连接;若产生的粘性末端经特殊酶处理,使单链突出处被补齐或削平,变为平端,也可实行平端连接。

  2、加尾连接:同聚物加尾连接是利用同聚物序列,如多聚A与多聚T之间的退火作用完成连接。在末端转移酶作用下,在DNA片段端制造出粘性末端,而后进行粘性末端连接。这是一种人工提高连接效率的方法,也属于粘性末端连接的一种特殊形式。

  3、人工接头连接:对平端DNA片段或载体DNA,可在连接前将磷酸化的接头(linker)或适当分子连到平端,使产生新的限制性内切酶位点。再用识别新位点的限制性内切酶切除接头的远端,产生粘性末端。

  选择合适(抗性标记、酶切位点等)的克隆载体(为了保真扩增),并将PCR片段连接入克隆载体中;(一般用Taq酶的PCR产物在末尾会自带一个A,可在Solution 1作用下与两端各带一个T的线性T载体直接相连)